RELATORIOS 02_2015

FACULDADE DE IMPERATRIZ – FACIMP

CURSO DE FARMÁCIA

ALICIA SILVA ALMEIDA

AMANDA DE SOUSA MATOS

ANA PATRICIA GONÇALVES SILVA

ANTONIA EURICE LIMA DE CARVALHO

ATHINA THAIS LIMA DA SILVA

GILVAMAR RODRIGUES SANTIAGO JÚNIOR

GIULIA PAULA REIS

GUSTAVO CESAR DE LIMA SANTOS

KELLY CRISTINA MENEZES LIMA SARAIVA

MAYSA RIBEIRO FARIAS

MARISA DE SOUSA PEREIRA

VALÉRIA MORAIS GOMES

RELATÓRIOS DE MICROBIOLOGIA BÁSICA

Relatórios de Prática da disciplina de Microbiologia Básica do curso de Farmácia apresentado à Faculdade de Imperatriz – FACIMP, sob a orientação do Professor Dr. Luis Carlos Figueira de Carvalho.

  

SUMÁRIO

1 COLORAÇÃO DE GRAM...........................................................................................03

2 OBSERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS...............................................................07

3 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA.......................................................................09

4 USO DA AUTOCLAVE...............................................................................................11

5 AÇÃO DA RADIAÇÃO U.V. SOBRE O CRESCIMENTO BACTERIANO..........14

6 AÇÃO DE ANTISSÉPTICOS......................................................................................15

7 ANTIBIOGRAMA........................................................................................................17

1 COLORAÇÃO DE GRAM 

         As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta, enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas pela safranina e se apresentam róseas.

Comentários:

Em 1884, o médico Dinamarquês Cristian Gram descobriu, empiricamente, ao corar cortes histológicos com violeta genciana, através do método de Ehrlich (1882), que as bactérias que eles continham não eram descoradas pelo álcool, se previamente tratadas com solução de iodo. Ele adicionou a este procedimento um contra-corante (safranina, fucsina básica, etc.,) e estabeleceu, a partir dai, uma metodologia de coloração diferencial.

Ao longo destes anos, o mecanismo de coloração de Gram foi sobejamente estudado. E nesta medida, muitas modificações foram propostas, sem contudo afetar substancialmente a idéia original.

Os microrganismos respondem diferentemente ao método. Há os que retêm o pigmento característico do corante (cristal violeta) em vista da formação de um complexo com a solução iodo-iodeto (lugol), apesar da lavagem com álcool ou acetona, motivando uma desidratação da parede celular, diminuição da porosidade e da permeabilidade. São os Gram-positivos. E há os que permitem a remoção do pigmento do corante pela lavagem com álcool ou acetona, em decorrência da extração de lipídios da parede, o que leva a um aumento da porosidade celular. São os Gram-negativos. Tratando, os dois grupos, com contra-corante (safranina ou fucsina básica) observa-se que as células do primeiro (Gram-positivos) não são afetadas e permanecem azuis ou violeta; enquanto que para o outro (Gram-negativos) as células absorvem o contra-corante, tornando-as vermelhas.

A parede celular bacteriana apresenta particularidades na sua composição química. Este dado é absolutamente coincidente com a resposta à reação de Gram. A presença de maior teor de peptideoglicano nos Gram-positivos, tem sido apontada como fator determinante da retenção do complexo ao nível de parede. Tanto assim que os protoplastos, produzidos por ação de lisozima ou por efeito de penicilina sobre os Gram-positivos, não são capazes de reter o pigmento, após lavagem com álcool ou acetona. Portanto, a reação de Gram resulta essencialmente das interações do complexo, cristal violeta ou violeta de genciana e iodo, com o peptideoglicano da parede celular, numa combinação ainda não de todo esclarecida, na qual a presença de ribonucleato de magnésio é mediadora da fixação do corante.

A reação de Gram tem largo relacionamento com o estado fisiológico da célula. As culturas jovens respondem melhor à diferenciação tintorial. As culturas velhas de Gram-positivas podem se apresentar como Gram-variável, pela perda da capacidade de retenção do corante.

A coloração é hoje empregada com elevado significação taxonômica. Assim, são Gram-positivos quase todos os bacilos esporulados, móveis por flagelos peritríquios e a quase totalidade dos cocos. São Gram-negativos a quase totalidade dos bacilos não esporulados, móveis por flagelos peritríquios  ou polares, e todas as espiroquetas, apenas para citar alguns exemplos.

Objetivo: Observar formas, disposição e comportamento tintorial das bactérias. Distinguir bactérias Gram-positivas das Gram-negativas.

Princípio: O método de Gram permite classificar  as bactérias em dois grandes grupos: as que retêm Violeta de genciana ( Gram-positiva ) e as que não retém o violeta genciana (Gram-negativa). Além do mais, é útil para determinar a forma ( cocos e bacilos ), e o arranjo das células após a divisão celular (em forma de cacho, cadeias, sarcina  etc., ). As células bacterianas são caracterizadas morfologicamente:

• Comportamento tintorial: Gram-positiva ou Gram-negativa
• Forma: cocos (esféricos), bacilos (cilíndricos) e espirilos (espiralados)
• Arranjo: Disposição das células entre si. Os cocos podem estar isolados, aos pares (diplococos), agrupados em cachos (estafilococos), em cadeia (estreptococos). Os bacilos e espirilos se apresentam em geral como células isoladas porém,  ocasionalmente,   pode-se   observar   bacilos  aos  pares (diplobacilos)  ou  em cadeia ( estreptobacilos ).

Quanto ao tamanho, as células bacterianas são sempre de dimensões microscópicas, o diâmetro da maioria delas varia de 0,2 a 1,5 mm e comprimento de 1 a 6 mm.

Material: Reagentes de Gram: sol. cristal-violeta 2%; sol. aquosa de iodo (Lugol); mistura álcool-acetona; sol. alcoólica  de safranina[1], Lâminas: Suporte para lâminas; alça de platina; Bico de Bunsen;  Microscópio; Óleo de Imersão.

Métodos:               

• Preparar o esfregaço e FIXAR ao calor
• Cobrir a área do esfregaço com a solução  de cristal-violeta  por cerca de 1min.;
• Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;
• Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;
• Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;
• Cobrir o esfregaço com a solução de safranina¹ por cerca de 30 segundos;
• Lavar com água corrente;
• Deixar secar ao ar.

            Os resultados após a coloração de Gram permitem classificar as bactérias em dois grupos:

Quando as estruturas celulares são cobertas pelo corante violeta-de-metila, todas se coram em roxo. Com a adição do mordente (Soluto de Lugol), ocorre à formação do complexo iodo-pararosanilina, que tem como proprieda de FIXAR o corante primário nas estruturas coradas.

Algumas estruturas perdem a cor violeta rapidamente, quando ocorre a lavagem, com ácool etílico, enquanto outras perdem sua coloração mais devagar ou a perdem completamente. O corante safranina colore novamente as estruturas que foram descoradas.

As bactérias Gram-positivas, que têm a parede celular composta por mureína (peptídeoglicano – peptídeo de ácido n-acetil murâmico), durante o processo de descoloração com álcool etílico, retém o corante, permanecendo com a coloração conferida pelo corante primário (roxo).  Já as bactérias Gram-negativas com parede celular composta predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas), perdem o complexo iodo-pararosanilina, são incapazes de reter o violeta de Genciana, assumindo a cor do corante de fundo (vermelha).

São as diferenças da estrutura da parede bacteriana, principalmente com relação à espessura da camada de peptidoglicano, que é responsável pelo diferente comportamento das bactérias diante da coloração de Gram.

REAGENTES PARA COLORAÇÃO DE GRAM

Cristal Violeta Solução A Cristal-violeta..    2g         Álcool etílico .. 20ml            Solução B Oxalato de amônio - 0,8g    Água destilada ....... 80 ml MISTURA A + B

Contracorante Solução estoque: Safranina 2,5 g / 100ml Solução uso: Diluir sol. estoque 1/10

Lugol Iodo ...........................1g Iodeto de potássio -2g    água destilada -   300ml

Resultados:

1º Lâmina analisada

Secreção Auricular

- Característica tintorial: Gram - positiva

- Forma: Cocos

- Arranjo: Cocos isolados

2º Lâmina analisada

Secreção Vaginal

- Característica tintorial: Gram - positiva

- Forma: Cocos

- Arranjo: Cocos isolados

            3º Lâmina analisada

Secreção Nasal

- Característica tintorial: Gram - negativo

- Forma: Cocos e Bacilos

- Arranjo: Cocos e Bacilos isolados

Conclusão:

            A partir dessa prática foi observada a morfologia bacteriana por meio do microscópico óptico. Além disso, utilizou-se o método tintorial que é predominantemente utilizado em bacteriologia, é o método de Gram. A bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com diagnóstico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmatório em alguns casos, constituindo-se uma peça importante e fundamental. Essa técnica é simples, rápida e tem capacidade de resolução, permitindo o correto diagnóstico em cerca de 80% dos pacientes em caráter de pronto atendimento em nível local.

2 OBSERVAÇÃO DE MICRORGANISMOS

Existem dois métodos gerais utilizados para preparar espécimes microbiológicos para observação de microrganismos por meio do microscópico luminoso:

Técnica entre lâmina e lamínula e gota pendente - utiliza uma suspensão de microrganismos vivos em uma gota ou uma camada líquida. Estas preparações (a fresco) são especialmente úteis quando a estrutura de um microrganismo pode ser distorcida pelo calor ou agentes químicos, ou quando o microrganismo não se cora facilmente.

Técnicas de Coloração - a camada fina do espécime é seca e corada, assim os microrganismos ficam fixados à superfície e apresentam-se corados para facilitar a visualização. Usadas para mostrar as várias estruturas dos microrganismos, para identificar e separar suas estruturas internas e para ajudar a identificar e separar microrganismos similares.

As principais etapas do preparo de um espécime microbiano corado para exame microscópico são: 1 - Confeccionar um esfregaço, ou uma camada fina do espécime sobre uma lâmina de vidro; 2 - Fixar o esfregaço seco à lâmina, usualmente com o calor, para fazer aderir o microrganismo à lâmina; 3 - Coloração com um ou mais corantes.

·         Coloração Simples - a coloração de microrganismo com uma única solução de corante; ex: azul de metileno para leveduras, ou bolores.

·         Coloração de Gram - neste processo, o esfregaço bacteriano é tratado com os reagentes na seguinte ordem: o corante púrpura cristal violeta, a solução de iodo (substância que fixa o corante no interior da célula), o álcool (remove o corante de certas bactérias) e o corante vermelho safranina.

Bactérias Gram-positivas, retém o corante cristal violeta e aparecem coradas em violeta-escuro;  Bactérias Gram-negativas, perdem o cristal violeta quando tratadas com álcool, são então coradas com o corante safranina e aparecem coradas em vermelho.

·         Coloração diferencial - envolve mais de uma solução de corante; ex: coloração de álcool-ácido para bactéria causadora da tuberculose; distingue esta bactéria patogênica, por meio da cor (vermelho, pelo corante principal), de outras bactérias (azul, pelo corante do fundo) encontradas em amostras como saliva e escarro.

 OUTROS MÉTODOS DE COLORAÇÃO:

• VERMELHO CONGO Þ Espiroquetas (Leptospira)
• ALBERT-LAYBOURT Þ Grânulos metacromáticos (C. diphtheriae )
• HISS Þ Cápsulas ( Klebsiella sp. )
• WIRTZZ Þ Esporos ( Bacillus sp. )
• SABATUCCI Þ Esporos ( Bacillus sp. )

Procedimento:

·         Para preparar o H sangue coletar 500 ml de sangue na placa e derramar o meio de Agar nutriente fundindo, resfriando, homogeneizando e aguardar a modificação.

·         Efeitos da U.V sobre crescimento o bacteriano.

·         Numerar 3 placas de Agar nutriente (5,10,15) e semear uma suspensão de bactérias em todas as placas.

·         Colocar as placas entre abertas na câmara asséptica e ligar a luz ultravioleta.

·         Na primeira placa retire com 5 minutos.

·         Na segunda prática retirar com 10 minutos.

·         Na terceira placa retirar com 15 minutos.

·         Incubar todas as placas e levar a estufa a 37º C por 24 a 48 horas.

Resultado

            Não foi possível obter resultados, pois as placas foram queimadas por desregulamento da estufa no momento que estava sendo utilizada. Obs.: duas vezes.

3 PREPARO DE MEIOS DE CULTURA

Desde o inicio, os microbiologistas aprenderam que podiam cultivar uma grande variedade de bactérias em “caldos”, obtidos pela cocção de tecidos animais ou vegetais. Em 1923, Mueller, tentando definir esta vaga necessidade, em termos de compostos específicos, descobriu o então desconhecido aminoácido, metionina. A nutrição bacteriana tornou-se campo dinâmico durante os anos subsequentes; porém com o reconhecimento da unidade bioquímica, os vários esquemas nutritivos revelaram ser simplesmente pequenas variações de um tema central e o estudo da nutrição bacteriana perdeu muito de seu interesse teórico. Apesar disso, este campo detém sua importância prática e ainda apresenta desafios; por exemplos, o bacilo da lepra, o treponema da sífilis e riquétsias não podem ser cultivados em meios artificiais.

Inicialmente, o único método existente para contagem de bactérias ou para o isolamento de culturas puras (clones), era a diluição até a extinção, isto é, até a perda da infectividade. Um progresso importante foi a introdução dos meios sólidos por Koch. Os materiais usados inicialmente eram pouco satisfatórios: a superfície da batata cortada podia permitir um crescimento confluente, enquanto que a gelatina permanecia sólida apenas em temperaturas relativamente baixas, sendo liquefeita por muitos microrganismos. Assim sendo, Frau Hesse, esposa de um médico e bacteriologista amador alemão, introduziu o ágar, um produto japonês que ela empregava  para engrossar as sopas.

            O ágar (do malaio “agar-ágar”) é um polissacarídeo obtido de certas algas marinhas (várias algas vermelhas). Constitui-se primariamente de galactose, com um radical sulfato para cada 10 ou 50 resíduos. O ágar mostrou-se ideal para formar meios sólidos. Não é tóxico para a bactéria, e muito poucas conseguem atacá-lo. Em concentrações de 1,5 a 2,0% apresentam uma superfície úmida para permitir crescimento, mas seca o bastante para manter separadas as colônias (Excepcionalmente, certos microrganismos móveis, como Proteus, exigem ágar a 5% para impedir a formação do véu).

            Após a fusão entre 80 e 100ºC, as soluções de ágar permanecem líquidas até 45-50ºC, temperatura que muitas bactérias toleram por alguns instantes; após a solidificação em temperatura ambiente, permanecem sólidas até muito acima de 37ºC. A estrutura fibrosa de um gel é suficientemente compacta para impedir a movimentação de bactérias no seu interior, mas bastante aberta para permitir a difusão, até mesmo de nutrientes macromoleculares.

Objetivo: Familiarizar o aluno com o preparo dos meios de cultura mais usados em microbiologia; Discutir a aplicação de meios para o cultivo de microrganismos distintos.

Princípio: Os microrganismos, para um crescimento adequado, necessitam de nutrientes (fontes de carbono, nitrogênio, enxofre, fosfato, etc.) e condições ambientais favoráveis (pH, pressão osmótica, temperatura, umidade, etc., ). Meios de cultura é associação qualitativa e quantitativa de substâncias que permitem o cultivo de microrganismos fora do meio natural. Em condições naturais, nos diversos “habitats”, os microrganismos ocorrem em populações mistas. Os meios de cultura permitem isolar os microrganismos para estudo e pesquisa.

 Material: Peptona, extrato de carne, ágar-agar,  ágar Mueller-Hinton, Caldo BHI, sangue de carneiro desfibrinado, tubos contendo 10ml de ágar-base estéril PH-metron, placas de Petri estéreis, pipetas de 1ml estéril, balança, provetas.

Equipamentos: Autoclave, cronômetro, Banho-Maria a 55ºC.

Método de MAC CONKEY:

·         Preparar o meio de cultura MAC CONKEY;

·         Pesar 4g de pó do ágar MAC CONKEY e adicionar em um copo descartável.

·         Adicionar o pó em um erlenmeyer e diluir com 100 mL de água destilada por meio de uma proveta.

·         Homogeneizar o erlenmeyer, colocar uma gaze na abertura e levar para o autoclave, que irá esterilizar o erlenmeyer.

·         Após o contato com o autoclave, ele irá solidificar.

·         Derreter no micro-ondas em cerca de 1min e distribuir para as placas estéreis.

Método de Ágar sangue:

·         Preparar ágar sangue.

·         Colocar 500 µl de sangue na placa com auxílio de uma pipeta semiautomática.

·         Esperar solidificar.

Resultados:

Foi somente a preparação de um meio de cultura para familiarizar aos alunos a técnica de meios de cultura.

4 USO DO AUTOCLAVE

A autoclave é um aparelho muito utilizado em laboratórios de pesquisas e hospitais para a esterilização de materiais. O processo de autoclavagem consiste em manter o material contaminado em contato com um vapor de água em temperatura elevada, por um período de tempo suficiente para matar todos os microorganismos.

A autoclave é formada por um cilindro metálico resistente, vertical ou horizontal, onde geralmente fica a resistência que aquecerá a água (A). Possui uma tampa que apresenta parafusos de orelhas (B) e permite fechá-la hermeticamente. Em cima da tampa estão a válvulas de segurança e de ar (C). Apresenta também uma chave de comando para controlar temperatura (D) e um registro indicador de temperatura e pressão (E).

AUTOCLAVAGEM PASSO A PASSO

Passo 1: Preparo do material a ser autoclavado

Antes de autoclavar é necessário preparar o material. As placas de Petri, espátulas, pipetas devem ser embaladas com papel craft. Frascos com meio de cultura, água e soluções não devem ser totalmente fechados. Geralmente é utilizada uma rolha feita de algodão hidrofóbico (que não molha) e gaze. Essa rolha permite que o vapor entre dentro do frasco e esterilize a solução. Se o recipiente estiver totalmente fechado não haverá esterilização. É colocada uma fita adesiva indicadora de esterilização que mudará de cor após a autoclavação.

Passo 2: Verifique o nível da água.

Adicione água destilada suficiente para cobrir a resistência, de forma a impedir a oxidação do metal e danificação da resistência. Coloque o material no cesto (não coloque mais que um terço do volume do equipamento). Feche a autoclave, rodando as chaves dispostas. E ligue a autoclave no máximo.

Passo 3: Ligue a autoclave na chave MAX. Espere até começar a sair um jato de ar residual e feche a válvula. Depois que fechar a válvula, a temperatura e pressão começarão a subir.

Passo 4: Após aproximadamente 15 a 20 minutos, quando o registro estiver marcando 121° coloque na temperatura média. A partir desse momento começa a esterilização. Então deve-se marcar 15 ou 20 minutos, (dependendo do volume do material). Após esse período a autoclave deve ser desligada. Atenção: Espere a temperatura abaixar antes de abrir o equipamento. Retire o material ainda úmido da autoclave e deixe-o secar à temperatura ambiente ou em uma estufa. Observe que a fita indicadora mudará de cor.

Cuidados básicos para a eficiência da autoclavação:

Antes da esterilização

- Higienizar convenientemente os materiais:

-Material crítico deve permanecer em solução desinfetante durante 30 minutos, antes de se realizar a limpeza.

-Os instrumentais devem ser lavados manualmente com o uso de escovas, ou em lavadoras ultra-sônicas.

-Drenos, tubos, catéteres devem ser lavados com água e detergente apropriado; devem-se usar seringas para lavar e enxaguar a luz dos mesmos.

-Agulhas e seringas devem ser lavadas com detergente e enxaguadas abundantemente para que este seja removido completamente.

-Acondicionar os artigos em embalagens adequadas, que permitam a esterilização e a estocagem do artigo.

- Identificar os pacotes corretamente, não ultrapassar as dimensões de 30cm x 30cm x 50cm, e o peso de 7 kg. Colocar os pacotes pesados sob os mais leves; evitar encostá-los nas paredes da câmara, deixar espaço entre eles para facilitar a drenagem do ar e penetração do vapor. Não sobrecarregar o equipamento, utilizar apenas 80% de sua capacidade.

-Colocar a fita indicadora na embalagem externa e vedar os pacotes menores com a mesma.

-Recipientes como bacias, jarros, ou outros que possuem concavidade devem ser colocados com sua abertura para baixo para facilitar o escoamento do ar e da água resultante da condensação do vapor.

Durante a esterilização

-Verificar constantemente os indicadores de temperatura e pressão.

Após a esterilização

-A porta do aparelho deve ser aberta lentamente e deve permanecer entreaberta de 5 a 10 minutos.

-Os pacotes não devem ser colocados em superfícies metálicas logo após a esterilização, pois em contato com superfície fria o vapor residual se condensa e torna as embalagens úmidas, comprometendo a esterilização uma vez que a umidade diminui a resistência do invólucro de papel e interfere no mecanismo de filtração do ar.

-Não utilizar os pacotes em que a fita indicadora apareça com as listras descoradas após a esterilização.

Falhas no processo de autoclavação

As falhas neste processo podem ser mecânicas ou humanas.

Principais falhas humanas:

-Limpeza incorreta ou deficiente dos materiais;

-Utilização de invólucros inadequados para os artigos a serem esterilizados;

-Confecção de pacotes muito grandes, pesados ou apertados;

-Disposição inadequada dos pacotes na câmara;

-Abertura muito rápida da porta ao término da esterilização;

-Tempo de esterilização insuficiente;

-Utilização de pacotes que saíram úmidos da autoclave;

-Mistura de pacotes esterilizados e não esterilizados;

-Não identificação da data de esterilização e data-limite de validade nos pacotes;

-Desconhecimento ou despreparo da equipe para usar o equipamento.

Conclusão:    

De acordo com a prática, podemos concluir que a autoclavagem é um método de exposição de soluções e meios de cultura a temperaturas superiores a do ponto de ebulição da água, necessárias para a rápida destruição de esporos bacterianos. A pressão alta é somente um meio de obter água a temperaturas mais elevadas, do que a do seu ponto de ebulição à pressão atmosférica.

5 AÇÃO DA RADIAÇÃO U.V. SOBRE O CRESCIMENTO BACTERIANO

Objetivos: Demonstrar a ação da radiação U.V sobre o crescimento bacteriano.

Princípio: Propriedade da luz ultravioleta de agir sobre a bactéria inibindo o seu crescimento pela ação a nível de DNA, onde propicia a formação de dímeros de timina que interferem no mecanismo de replicação, transcrição e tradução de informações genéticas.

Material: Suspensão de bactérias em salina (E.coli, S.aureus, etc.), ágar Mueller-Hinton em placas, swab estéril, álcool comercial, becker de 250ml, bico de Bunsen.

 Método:   Introduzir o  swab estéril no tubo contendo a suspensão bacteriana, retirar o excesso e espalhar uniformente sobre toda superfície das 3 placas contendo ágar Mueller-Hinton. Expor às placas a radiação U.V., conforme o esquema abaixo:

• Placa 1: Expor à radiação U.V por 5 min.
• Placa 2: Expor à radiação U.V por 10 min.
• Placa 3: Expor à radiação U.V por 15 min.

Incubar todas as placas na estufa a 37ºC por 24 a 48horas.

Resultados:  Observar a formação de colônias em todas as placas e averiguar onde ocorreu maior e menor crescimento. Se possível determinar o nº de colônias em cada placa e  percentagem de inibição em função da placa controle.

Conclusão:

Quanto ao local, pode-se dizer que ocorreu um menor crescimento na parte exposta da placa e um maior crescimento na parte coberta pelo vidro. Isso porque a radiação U.V não possui um alto poder de penetração.

Quanto ao tempo, pode-se relatar que ocorreu um menor crescimento na placa de 15 minutos na área exposta a radiação, porque a ação U.V. vai matando as bactérias gradativamente, sendo que a intensidade aumenta com o decorrer do tempo.

Entendendo assim, infere-se que a luz U.V (luz ultra-violeta) interfere no crescimento bacteriano, sendo um fator antimicrobiano para as colônias laboratoriais.

6 AÇÃO DE ANTISSÉPTICOS

Define-se como antisséptico (anti, contra e sepsis, putrefação), toda substância capaz de impedir a proliferação das bactérias, seja inativando-as (efeito bacteriostático), seja destruindo-as (efeito germicida). O vocábulo deveria restringir-se ao emprego em tecidos vivos, como exemplo na antissepsia das feridas, ao contrário do termo desinfetante, reservado ao caso de substâncias inanimadas, como na desinfecção de fômites ou excretos. Na prática, porém, tais conceitos nem sempre delimitam perfeitamente, empregando-se como sinônimos. Assepsia é o conjunto de meios usados para impedir a penetração de germes em local que não os contenha.

Devido à constante exposição e contato com o meio ambiente, a pele está particularmente propensa a abrigar microrganismos transitórios. Todavia, dispõe de uma microbiota residente constante e bem definida, modificada em diferentes regiões anatômicas por secreções, uso de roupas ou proximidade de mucosas (boca, nariz, áreas perineais, etc.). A Microbiota da pele está caracterizada principalmente por bacilos difteróides aeróbios, estafilococos aeróbios não hemolíticos, bacilos Gram-positivos aeróbios, estreptococos alfa-hemolíticos, enterococos, bacilos coliformes Gram-negativos e Acinetobacter.

Objetivos: Verificar a ação dos agentes químicos sobre a microbiota residente nas mãos e os fatores que influenciam no processo da assepsia das mãos. Demonstrar técnicas eficientes de assepsia.

Princípio: Eliminação parcial dos microrganismos na superfície corpórea pela ação de agentes químicos que não agridem o tecido (detergentes, sabão, álcool, iodo, etc) e ação mecânica da escovação.

Material: Sabão ou sabonete, escova de unhas, álcool iodado, alcool a 70%, ágar Mueller-Hinton em placas, caldo BHI em tubos, galeria para tubos, salina estéril, swab estéril.

Método: 

·         Preparar o meio de cultura em um erlenmeyer e levar para o autoclave;

·         Após isso, fundir (derreter) o meio contido no erlenmeyer utilizando o micro-ondas;

·         Distribuir o meio para duas placas estéreis;

·         Selecionar um voluntário para realizar o procedimento;

·         O voluntário deve colocar qualquer mão diretamente na placa de Petri estéril (1), sem realizar a assepsia;

·         Após isso, ele deve realizar o processo de lavagem e assepsia da mão que foi posta sobre a placa, utilizando água, sabão, detergente e álcool 70%;

·         Esperar alguns minutos para secar;

·         Concluído o processo, o voluntário irá colocar novamente a mão, que agora já passou pelo processo de assepsia, sobre outra placa de Petri (2);

·         Enumerar as placas e colocá-las na estufa a uma temperatura de cerca de 37ºC e em um período de 24h, para análises posteriores.

 Resultados:

            Os resultados não foram totalmente elucidados, mas pode-se sugerir a seguinte interpretação:

Na placa com a mão sem assepsia (1), espera-se encontrar uma grande quantidade de microrganismos residentes normais da pele, não gerando nenhum tipo de interferência.

Na placa com a mão com assepsia (2), espera-se encontrar uma pequena população de microrganismos residentes da pele, pois foi exercida uma influência através da inserção de antimicrobianos, reduzindo significativamente a quantidade de micróbios.

Conclusão:

            Por meio dessa prática, pode-se inferir que os produtos antissépticos são eficazes no processo de assepsia, pois podem reduzir significativamente a população de micro-organismos residentes e transientes da microbiota da pele e, portanto, controlar o risco de infecções.

7 ANTIBIOGRAMA

Introdução: O antibiograma é um teste laboratorial realizado para detectar com mais precisão a bactéria a ser eliminada, dizendo em melhores palavras e mais simples, é um exame que irá verificar por meios de técnicas especificas a bactéria que esta hospedada no paciente e causando sintomas específicos.

Objetivos: Determinar a susceptibilidade de microrganismos a diferentes antibióticos por meio da técnica de difusão em ágar. Interpretar um antibiograma em função do diâmetro do halo de inibição de diferentes antibióticos.

Princípio: Os antibióticos impregnados nos discos, difundem no ágar e formam um halo de inibição ao seu redor quando encontram bactérias sensíveis. A bactérias resistentes crescem próximo ao disco, não ocorrendo a formação de halo.

Material: Placas contendo ágar Mueller-Hinton, Microrganismo isolado em cultura pura (E.coli ou S.aureus) e suspenso em salina (inóculo), Discos adesivos de antibióticos.

Método:

·         Preparar o meio de cultura em um Erlenmeyer.

·         Derreter e distribuir entre as placas de Petri.

·         Contornar a superfície da placa de Petri com uma suspensão de bactérias.

·         Colocar o disco adesivo de antibióticos (Gram-positivo e Gram-negativo) ao redor das placas de Petri.

·         Levar as placas para a estufa a uma temperatura de 37ºC em um período de 24 horas.

·         Observar o resultado do antibiograma.

Conclusão:

            Nessa prática, pode-se observar a ação dos antibióticos. O Disco adesivo possui a função de identificar áreas de decrescimento bacteriano e associá-las ao antibiótico empregado próximo ao local. Portanto, o antibiograma é bastante utilizado no dia a dia dos laboratórios, pois é responsável pela identificação de antibióticos mais eficazes para determinados microrganismos e, assim, determinar o medicamento mais viável para o tratamento de pacientes.

FACULDADE DE IMPERATRIZ – FACIMP

CURSO DE FARMÁCIA

ADRIANA JHENE

JUAN PEREIRA DA SILVA

JOSÉ VINCIUS DOS ANJOS

CAMILA DUARTE

MARIA BRENDA

AULAS PRÁTICAS DE MICROBIOLOGIA

Trabalho apresentado a Faculdade de Imperatriz – FACIMP do curso de Farmácia para obtenção de notas na matéria de Microbiologia.

Orientador (a): Dr: Luis Carlos Figueira.

Pratica 01 – Coleta de Material

·         INTRODUÇÃO

A coleta, a conservação e o transporte de material ou amostra clínica constituem a base do trabalho microbiológico, que culmina com a identificação do agente infeccioso e o perfil de sensibilidade aos antimicrobianos. A padronização desses procedimentos reflete na melhor utilização dos recursos da microbiologia, com maior qualidade dos resultados e economia de recursos.

·         PROCEDIMENTO

1- Passar o suabe na mucosa

2- Fazer o esfregaço na lâmina

3- Colocar o cristal violeta esperar 1 minuto

4- Colocar o lugol aguardar 1 minuto

5- Levar no bico de bunsem para fixar

6- Coloca fucsina e aguardar 30 segundo.

·         MATERIAS

Suabe

Lugol

Lâmina

Fucsina

Bico de bunsem

Cristal violeta

Prática 02 – Coloração de Gram

·         INTRODUÇÃO

A coloração de Gram (nome atribuído em homenagem ao seu inventor, Hans Christian Gram), é um teste laboratorial usado para detetar a presença de microrganismos, principalmente bactérias, numa amostra retirada do foco de infeção. Este teste determina, de forma relativamente rápida, a estirpe bacteriana presente na amostra. Numa coloração de Gram a amostra é fixada a uma lâmina de vidro e deixada a secar. É aplicada então à lâmina uma coloração especial e, em seguida, observa-se ao microscópio.

·         OBJETIVO

Observar formas, disposição e comportamento tintorial das bactérias. Distinguir bactérias Gram-positivas das Gram-negativas.

·         MATERIAIS

Solução cristal-violeta 2%;

Solução aquosa de iodo (Lugol);

Mistura álcool-acetona;

Solução alcoólica  de safranina;

Suporte para lâminas;

Alça de platina;

Bico de Bunsen;

Microscópio;

Óleo de Imersão.

·         PROCEDIMENTOS

1)    Preparar o esfregaço e fixar ao calor

2)    Cobrir a área do esfregaço com a solução  de cristal-violeta  por cerca de 1min.;

3)    Lavar com água corrente e escorrer o excesso de água;

4)    Cobrir a área do esfregaço com a solução de iodo durante cerca de 1 minuto;

5)    Descorar a lâmina com a mistura álcool-acetona, até que o solvente escorra incolor;

6)    Cobrir o esfregaço com a solução de safranina1 por cerca de 30 segundos;

7)    Lavar com água corrente;

8)    Deixar secar ao ar .

·         RESULTADOS

As bactérias Gram-positivas retêm o cristal-violeta e se apresentam com coloração violeta, enquanto as Gram-negativas são descoradas pelo álcool-acetona, sendo, portanto, coradas pela safranina e se apresentam róseas.

·         CONCLUSÃO

A realização de testes básicos para identificação de bactérias, através do método de coloração de Gram, permitiu-se concluir que existem diferenças significativas na composição da parede celular de bactérias Gram positivas e Gram negativas. O mecanismo de reação de Gram demonstrou-se um método eficiente de coloração diferencial, podendo-se, através dos resultados obtidos, diferenciar bactérias Gram positivas de Gram negativas, atuando como ferramenta auxiliar, na identificação de bactérias fitopatogênicas.

Prática 03 – Observação de Microorganismo

·         INTRODUÇÃO

O esfregaço bacteriano é tratado com os reagentes na seguinte ordem: o corante púrpura cristal violeta, a solução de iodo (substância que fixa o corante no interior da célula), o álcool (remove o corante de certas bactérias) e o corante vermelho safranina.

·         OBJETIVO

Verificar a presença de microorganismos em objetos/ambientes em meios de cultura.

·         PROCEDIMENTOS

1 - Confeccionar um esfregaço, ou uma camada fina do espécime sobre uma lâmina de vidro.

2 - Fixar o esfregaço seco à lâmina, usualmente com o calor, para fazer aderir o microrganismo à lâmina.

3 - Coloração com um ou mais corantes.

·         RESULTADOS

Observou-se as estruturas dos microrganismos.

  

Prática 04 – Meio de Cultura

·         INTRODUÇÃO

Meios de cultura são composições de substâncias que fornecem nutrientes necessários para o desenvolvimento de microrganismos. Sendo favorecido o crescimento, é possível a identificação desses organismos através das suas atividades bioquímica e metabólica. Além dos nutrientes, existem condições ambientais para o crescimento microbiano, como temperatura, pH, umidade, presença ou não de oxigênio (condição aeróbia e anaeróbia), entre outros.

·         OBJETIVO

Familiarizar o aluno com o preparo dos meios de cultura mais usados em microbiologia; Discutir a aplicação de meios específicos para o cultivo de microrganismos distintos.

·         MATERIAIS

Peptona;

Extrato de carne;

Àgar-agar;

Àgar Mueller-Hinton;

Caldo BHI;

Sangue de carneiro desfibrinado;

Tubos contendo 10ml de ágar-base estéril PH-metron;

Placas de Petri estéreis;

Pipetas de 1ml estéril;

Balança;

Provetas;

Autoclave;

Cronômetro;

Banho-Maria a 55ºC.

·         PROCEDIMENTOS

Suspender 38,0g em 1000ml de água destilada ou deionizada e aquecer até ebulição para dissolver completamente. Esterilizar em autoclave durante 10 min, a 15 Atm pressão (121ºC), esfriar a 50ºC e distribuir em placas de Petri.

·         RESULTADOS

Após a fusão entre 80 e 100ºC, as soluções de ágar permanecem líquidas até 45-50ºC, temperatura que muitas bactérias toleram por alguns instantes; após a solidificação em temperatura ambiente, permanecem sólidas até muito acima de 37ºC. A estrutura fibrosa de um gel é suficientemente compacta para impedir a movimentação de bactérias no seu interior, mas bastante aberta para permitir a difusão, até mesmo de nutrientes macromoleculares.

Prática 05 – Ação da Radiação U.V

·         INTRODUÇÃO

Maior parte do espectro ultra violeta, a radiação UVA (comprimento de onda entre 315 e 400 nm) possui intensidade constante durante todo o ano, atingindo a pele praticamente da mesma forma durante o inverno ou o verão. Sua intensidade também não varia muito ao longo do dia, sendo pouco maior entre 10 e 16 horas do que nos outros horários.

A radiação UVA penetra profundamente na pele e suprime o sistema imune, sendo a principal responsável pelo fotoenvelhecimento. Tem importante participação nas fotoalergias e também predispõe a pele ao surgimento do câncer.

Os raios UVA também estão presentes nas câmaras de bronzeamento artificial, em doses mais altas do que na radiação proveniente do sol.

·         OBJETIVOS

Demonstrar a ação da radiação U.V sobre o crescimento bacteriano.

·         MATERIAIS

Suspensão de bactérias em salina (E.coli, S.aureus, etc.);

Àgar Mueller-Hinton em placas;

Swabestéril;

Àlcool comercial;

Becker de 250ml;

Bico de Bunsen.

·         PROCEDIMENTOS

Introduzir o  swab estéril no tubo contendo a suspensão bacteriana, retirar o excesso e espalhar uniformente sobre toda superfície das 5 placas contendo ágar Mueller-Hinton. Expor as placas a radiação U.V., conforme o esquema abaixo:

Placa 1: não expor à radiação U.V (CONTROLE)

Placa 2: Expor à radiação U.V por 10 seg.

Placa 3: Expor à radiação U.V por 30 seg.

Placa 4: Expor à radiação U.V por 60 seg.

Placa 5: Expor à radiação U.V por 180 seg

Incubar todas as placas na estufa a 37ºC por 24 a 48horas.

·         RESULTADOS

Observou-se que com 5 minutos já é tempo suficiente para que a Radiação U.V elimine 99% das colônias bacterianas.

Prática 06 – Ação dos Antissépticos

·         INTRODUÇÃO

Podemos afirmar que todas as substâncias e produtos destinados a higienização, desinfecção, ações com finalidade de destruir e inibir a multiplicação e proliferação de microrganismos patogênicos, podem ser entendidos como antissépticos. Mas antissépticos são substâncias e produtos capazes de agir como o comentado acima, em tecidos vivos sobre a cútis(pele) e mucosas(boca), sem causarem lesões ou irritações.

Eles são feitos para aplicação em humanos e animais que necessitem de higienização em áreas do corpo contaminadas, ferimentos, na higiene bucal (como coadjuvante na prevenção dos males da boca, como halitose, cárie e placas bacterianas), entre outras que precisem de tratamento ou prevenção contra agentes patogênicos.

·         OBJETIVO

Verificar a ação dos agentes químicos sobre a microbiota residente nas mãos e os fatores que influenciam no processo da assepsia das mãos. Demonstrar técnicas eficiente de assepsia.

·         MATERIAIS

Sabão ou sabonete;

Escova de unhas;

Àlcool a 70%;

Àgar Mueller-Hinton em placas;

Caldo BHI em tubos;

Galeria para tubos;

Salina estéril;

Swab esteril.

·         PROCEDIMENTOS

1) Preparar a placa de Petri com o meio de cultura, levar a geladeira para solidificar.

2) Passar a mão suja na placa.

3) Lavar as mãos com todos os antissépticos e por fim passar álcool 70%.

4) Colocar novamente a mão esterilizada em outra placa de Petri para realizar a comparação.

5) Levar para a estufa 37,5ºC.

·         RESULTADOS

Placa da esquerda sem assepsia, placa da direita após a assepsia.

Método é eficiente consegue remover grande quantidade das colônias de bactérias contida na mão do individuo.

  

Pratica 07 – Autoclave

·         INTRODUÇÃO

A autoclave é um aparelho muito utilizado em laboratórios de  pesquisas e hospitais para a esterilização de materiais. O processo de autoclavagem consiste em manter o material contaminado em contato com um vapor de água em temperatura elevada, por um período de tempo suficiente para matar todos os microorganismos.

A autoclave é formada por um cilindro metálico resistente, vertical ou horizontal, onde geralmente fica a resistência que aquecerá a água (A). Possui uma tampa que apresenta parafusos de orelhas (B) e permite fechá-la hermeticamente. Em cima da tampa estão a válvulas de segurança e de ar (C). Apresenta também uma chave de comando para controlar temperatura (D) e um registro indicador de temperatura e pressão (E)

·         PROCEDIMENTOS

Passo 1: Preparo do material a ser autoclavado

Antes de autoclavar é necessário preparar o material. As placas de Petri, espátulas, pipetas devem ser  embaladas com papel craft. Frascos com meio de cultura, água e soluções não devem ser totalmente  fechados. Geralmente é utilizada uma rolha feita de algodão hidrofóbico (que não molha) e gaze. Essa  rolha permite que o vapor entre dentro do frasco e esterilize a solução. Se o recipiente estiver totalmente fechado não haverá esterilização. É colocada uma fita adesiva indicadora de esterilização que mudará de cor após a autoclavação.

Passo 2: Verifique o nível da água.

Adicione água destilada suficiente para cobrir a resistência, de forma a impedir a oxidação do metal e danificação da resistência. Coloque o material no cesto (não coloque mais que um terço do volume do equipamento). Feche a autoclave, rodando as chaves dispostas. E ligue a autoclave no máximo.

Passo 3:

Atenção: Ao utilizar uma autoclave pela primeira vez, peça alguém que já tenha experiência com este aparelho para te acompanhar.

Então para começar...

Ligue a autoclave na chave MAX. Espere até começar a sair um jato de ar residual e feche a válvula. Depois que fechar a válvula a temperatura e pressão começarão a subir.

Passo 4

Após aproximadamente 15 a 20 minutos, quando o registro estiver marcando 121° coloque na temperatura média. A partir desse momento começa a esterilização. Então se deve marcar 15 ou 20 minutos, (dependendo do volume do material). Após esse período a autoclave deve ser desligada.

Atenção: Espere a temperatura abaixar antes de abrir o equipamento.

Retire o material ainda úmido da autoclave e deixe-o secar à temperatura ambiente ou em uma estufa. Observe que a fita indicadora mudará de cor

Prática 08 – Antibiograma

·         INTRODUÇÃO

Um antibiograma é o resultado de um exame laboratorial para a sensibilidade de uma linhagem de bactéria isolada para diferentes antibióticos. É, por definição, um teste de sensibilidade in vitro.

Na clínica, antibióticos são frequentemente prescritos com base em guias gerais do conhecimento a respeito da sensibilidade, ex: infecções urinárias sem complicações podem ser tratadas com quinolonas de primeira geração, etc. Isso ocorre porque a Escherichia coli é o provável patógeno, e é sabidamente sensível ao tratamento com quinolonas

·         PROCEDIMENTO

1) Colocar o meio de cultura em uma Placa de Petri;

2) Levar a geladeira para solidificar;

3) Colocar o swab no tubo de ensaio com as bactérias e depois fazer o esfregaço na placa de Petri.

4) Colocar na estuda a 37,5º C.

·         RESULTADO

Observou-se que as bactérias que não era resistente aos antibióticos próximos não cresceram colônias. Salientando que o método de antibiograma é eficaz para verificar se a bactéria é resistente ao antibiótico.